Comparação de métodos convencionais e reação em cadeia da polimerase em tempo real na detecção de infecção pelo citomegalovírus in vitro

Comparação de métodos convencionais e reação em cadeia da polimerase em tempo real na detecção de infecção pelo citomegalovírus in vitro

Alternative title Comparison of conventional methods and real-time polymerase chain reaction in the detection of the cytomegalovirus infection in vitro
Author Cezar, Amanda Cristina Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Pacheco-Silva, Alvaro Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Medicina (nefrologia) – São Paulo
Abstract Introduction: Clinical isolates of Cytomegalovirus (CMV) are easily spread in vitro resulting in impairment of the monolayer cell where the virus was inoculated, thus evidencing the presence or absence of infection. The cell culture is a classic method for detection of CMV and it was widely used in the past. Antigenemia assay, which detects CMV pp65 antigen, is the method most used currently in clinical practice, because it is faster and specific for detection of the active infection. Recently, the real-time PCR has been used in monitoring of the infection through the quantification of viral load for being a high sensitivity and specificity method to viral DNA. Therefore, the aim of the study was employing tests used in diagnosis and monitoring of infection to the standard CMV strain as a protocol for implantation in experiments in vitro. Methods: Quiescent human fibroblasts in confluent monolayer were inoculated with samples of infected cells by the adapted CMV AD169 strain. The effect of the virus on culture was monitored at 1 hour, 24 hours, 48 hours and 72 hours post infection (h.p.i) by observation of cytopathic effect. The same samples were analyzed by antigenemia being estimate the mean of positive cells in 2x105 cells and by real-time PCR being estimate the mean of copies of viral DNA/Log10 present in samples. Results: Cytopathic effect was first noticed 24 h.p.i, showing that the initiation of morphological changes occurred early. This effect became more intense after 72 h.p.i. Antigenemia assay showed the presence of active infection through pattern of labeling of the pp65 viral antigen found on nucleus of infected cells, while the real-time PCR showed the number of copies of viral DNA in different times of infection. Antigenemia showed an mean of 57 ±56 positive cells 1h.p.i. The peak of the infection was reached 24h.p.i with a significant increase in the mean 2.381 ±168 (P<0.05 versus 1h.p.i) and remained high 48h.p.i, showing an mean of 2.012 ±352 positive cells. However, the mean of antigenemia decrease 72h.p.i to 262 ±5 (P<0.05 versus 48h.p.i). As well as in antigenemia, a significant increase of th viral load was observed of 1h.p.i to 24h.p.i, being the mean of viral DNA detected 11.30 ±0.30 and 11.96 ±0.09, respectively (P<0.05). The levels of viral DNA stayed high 48h.p.i, being detected a mean of 12.33 ±0.26. After this period, viral load decreased significantly to 11.57 ±0.06 (P<0.05 versus 48h.p.i). No correlation was found between the quantitative methods of antigenemia and real-time PCR. Conclusion: The three methods, virus isolation, antigenemia and real-time PCR, showed the success of the CMV infection “in vitro” by cyto-morphological changes, detection of viral antigen specific and viral load by virus DNA detection, respectively. PCR method was more sensitive in detecting virus in relation the other methods. Although sensitive and specific, we consider the need for viral titration in any experimental studies in vitro.

Introdução: Isolados clínicos do Citomegalovirus (CMV) são facilmente propagados in vitro resultando em comprometimento da monocamada celular onde o vírus foi inoculado, evidenciando assim a presença ou ausência de infecção. A cultura celular é um método clássico para detecção do CMV e foi bastante utilizada no passado. O ensaio de antigenemia, que detecta o antígeno viral pp65 do CMV, é o método mais utilizado atualmente na prática clínica, por ser mais rápido e específico para detecção da infecção ativa. Recentemente a técnica de PCR em tempo real tem sido empregada no monitoramento da infecção por meio da quantificação da carga viral por ser um método de alta sensibilidade e especificidade ao DNA viral. Sendo assim, o objetivo do estudo foi empregar testes usados no diagnóstico e monitoramento da infecção clínica à cepa padrão do CMV como protocolo para implantação em experimentos in vitro. Métodos: Monocamada de células fibroblásticas humanas confluentes e em quiescência foram inoculadas com amostras de células infectadas pela cepa adaptada em laboratório do CMV AD169. O efeito do vírus sobre a cultura foi monitorado 1 hora, 24 horas, 48 horas e 72 horas após a infecção (h.p.i) através da observação do efeito citopático. As mesmas amostras foram analisadas por antigenemia estimando-se a média de células positivas em 2x105 células e por PCR em tempo real estimando-se a média de cópias de DNA viral/Log10 presente nas amostras. Resultados: Efeito citopático foi observado pela primeira vez 24 h.p.i, evidenciando que o início das mudanças morfológicas ocorreu precocemente. Esse efeito tornou-se mais intenso após 72h. O ensaio de antigenemia evidenciou presença de infecção ativa pelo padrão de marcação do antígeno viral pp65 encontrado no núcleo das células infectadas, enquanto que a PCR em tempo real evidenciou o número de cópias de DNA viral nos diferentes tempos de infecção. Antigenemia apresentou uma média 57 ±56 células positivas 1h.p.i. O pico da infecção foi alcançado 24h.p.i com um aumento significativo da média para 2.381 ±168 (P<0.05 versus 1h.p.i), mantendo-se elevado 48h.p.i, mostrando uma média de 2.012 ±352. Entretanto, os níveis de antigenemia diminuem significativamente 72h.p.i para 262 ±5 (P<0.05 versus 48h.p.i). Assim como na antigenemia, observou-se aumento significativo da carga viral de 1 h.p.i para 24 h.p.i, sendo uma média de DNA viral detectado 11.30 ±0.30 e 11.96 ±0.09, respectivamente (P<0.05 versus 1h.p.i). Os níveis de DNA viral se mantêm elevados 48h.p.i, sendo detectada uma média de 12.33 ±0,26. Após esse período, carga viral cai significativamente para 11.57 ±0.06 (P<0.05 versus 48h.p.i). Não foi encontrada correlação entre os métodos quantitativos de antigenemia e PCR em tempo real. Conclusão: Os três métodos utilizados, isolamento viral, antigenemia e PCR em tempo real evidenciaram o sucesso da infecção “in vitro” pelo CMV por meio de mudanças cito-morfológicas, detecção de antígeno viral específico e carga viral por detecção do DNA viral, respectivamente. A técnica de PCR se mostrou a mais sensível na detecção viral em relação às demais técnicas. Embora sejam métodos sensíveis e específicos, consideramos a necessidade da titulação viral em quaisquer ensaios experimentais in vitro.
Keywords Carga viral
Cultura de vírus
Efeito citopatogênico viral
Polymerase chain reaction
Proteínas da matriz viral
Reação em cadeia da polimerase
Viral cytopathogenic effect
Viral matrix protein
Viral culture
Viral load
Citomegalovírus
Cytomegalovirus
Language Portuguese
Sponsor Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Date 2009-09-30
Published in CEZAR, Amanda Cristina. Comparação de métodos convencionais e reação em cadeia da polimerase em tempo real na detecção de infecção pelo citomegalovírus in vitro. 2009. 87 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, 2009.
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 87 p.
Access rights Open access Open Access
Type Dissertation
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9211

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Name: Publico-00396.pdf
Size: 813.1Kb
Format: PDF
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