Avaliação de actinobactérias quanto à produção de enzimas ligninolíticas viabilizadoras da geração de bioetanol celulósico

Abstract

Os actinomicetos ou actinobactérias são bactérias Gram-positivas, com características semelhantes a fungos filamentosos, principalmente pelo lento crescimento e por suas células alongadas e ramificadas, denominadas hifas. Já foram descritos em ambientes como solo, lama, sedimentos marinhos e compostagem, sendo responsáveis pelo odor de “terra molhada”, estando relacionados com a produção de metabolitos secundários e a habilidade em oxidar compostos tais como fenóis e esteróides. Descritos em alguns ecossistemas unicamente brasileiros tais como a Caatinga, esses microrganismos são fontes de enzimas que podem tolerar amplas variações de temperatura, pH e salinidade. Assim, diante de uma coleção de 173 actinobactérias isoladas de amostras de solo e rizosfera da caatinga, tais foram avaliados quanto às suas habilidades enzimáticas, tendo-se como alvo peroxidases de interesse biotecnológico. Tais ensaios foram realizados de maneira miniaturizada, por métodos colorimétrico para detecção espectrofotométrica da atividade enzimática de DyPs (“Decolorizing Dye Peroxidases”) e Manganês Peroxidases (MnP). Os isolados AC01, AC13, AC127, AC140, AC171 e AC173 mostraram-se positivos para atividades de DyPs apresentando valores entre 500 e 800 UL-1

. Os isolados AC13, AC17, AC35, AC79, AC81, AC92, AC99, AC109, AC139, AC148, AC155 e AC160

foram selecionados por apresentarem valores de atividades de MnP de até 1.000 U.L- 1

, quando vermelho de fenol foi utilizado como substrato enzimático. Quando MnSO4 foi aplicado como cofator para a detecção da atividade de MnP, os isolados AC14 e AC173 foram selecionados, por apresentarem atividades entre 12 U.L -1 e 16 U.L-1 , respectivamente. Analisando-se os resultados obtidos pelas metodologias utilizadas, foram selecionadas as actinobactérias AC171 e AC173 para avaliação em ensaios pilotos para a verificação da atividade enzimático-bacteriana sobre fibras vegetais lignocelulósicas, fazendo-se uso de bagaço de cana-de-açúcar como substrato. Assim tais actinobactérias foram inoculadas sobre a biomassa vegetal e os experimentos foram monitorados por 42 dias, por meio de análises de MALDI-TOF. Tais ensaios permitiram a implementação de condições para o cultivo microbiano em biomassa vegetal, porém resultados não conclusivos não permitiram inferir sobre a atividade microbiana sobre o conteúdo lignocelulósico. Entretanto, considera-se o trabalho bem sucedido no que tange à seleção de actinobactérias eficientes quanto à produção de peroxidases de interesse biotecnológico e que pode ser aprimorado para diferentes frentes de produção industrial, tais como lignocelulósica.

Actinomycetes or actinobacteria are gram-positive bacteria with similar characteristics to filamentous fungi, mainly due to their slow growth and their elongated and branched cells, called hyphae. They have been described in environments such as soil, mud, marine sediment and composting, being responsible for the “wet earth” odour, and related to the production of secondary metabolites and the ability to oxidize compounds such as phenols and steroids. Found in Caatinga, an uniquely Brazilian ecosystem, these microorganisms are known as a source of enzymes that are able to tolerate wide variations in temperature, pH and salinity. Thus, a collection of 173 actinobacteria isolated from Caatinga soil and rhizosphere were analyzed in order to evaluate their enzymatic abilities, targeting peroxidases of biotechnological interest. The assays were performed in a miniaturized manner by colorimetric methods for spectrophotometric detection of the enzymatic activity of DyPs (Decolorizing Dye Peroxidases) and Manganese Peroxidases (MnP). The isolates AC01, AC13, AC127, AC140, AC171 and AC173 displayed positive results for DyPs activities with values between 500 and 800 UL-1. Strains AC13, AC17, AC35, AC79, AC81, AC92, AC99, AC109, AC139, AC148, AC155 and AC160 were selected once they showed MnP activity values up to 1,000 UL-1, when phenol red was used as enzyme substrate.With MnSO4 applied as a cofactor for the detection of MnP activity, isolates AC14 and AC173 presented activities between 12 U.L -1 and 16 U.L-1, respectively. From the results observed through the employed methodology approaches, the strains AC171 and AC173 were selected for pilot assays to verify the enzymatic-bacterial activity on lignocellulosic plant fibers, using sugarcane bagasse as substrate. Thus, such actinobacteria were inoculated on the plant biomass and the assays were monitored for 42 days through MALDI-TOF analysis. These results allow the implementation of conditions for microbial cultivation in plant biomass, however, it is still not possible to infer about the microbial activity on lignocellulosic content. Nevertheless, the goals of this project were achieved, regarding the selection of efficient actinobacteria for the production of peroxidases with biotechnological interest and which can be improved for different industrial production sources, such as lignocellulosic.