Inibição Da Via Jak/Stat Em Linhagens Celulares De Mieloma Múltiplo Como Potencial Alvo Terapêutico

Inibição Da Via Jak/Stat Em Linhagens Celulares De Mieloma Múltiplo Como Potencial Alvo Terapêutico

Author Oliveira, Mariana Bleker De Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Colleoni, Gisele Wally Braga Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Medicina (Hematologia)
Abstract The constitutive activation of JAK proteins in multiple myeloma (MM) promotes the survival and proliferation of tumor cells. The blockage of JAK proteins could contribute to reduce the auxiliary effect of aberrant signalization in multiple myeloma cells and pharmacological inhibition of JAKs could be a therapeutic strategy for myeloma treatment. Aims: 1) To identify, among MM cell lines, the expression of JAK/STAT pathway genes JAK1 and JAK2 and validate those finding in samples from patients recent diagnosed with MM; 2) To perform functional in vitro studies with previously selected MM cell lines, in monoculture and co-culture with normal stromal cells, treated with a JAK/STAT pathway inhibitor, associated with drugs currently used in MM first line treatment; 3) to evaluate global gene expression of JAK/STAT pathway and protein expression in previously selected cell lines, with and without treatment with JAK/STAT pathway inhibitor. Methods: JAK1 and JAK2 expression was analyzed by real time PCR. For the in vitro experiments, with ruxolitinib, bortezomib and the two drugs combination, concentrations were determined after verification of which concentration was able to induce, at least, 50% of cell death. Apoptosis (annexin V and propidium iodide staining) and cell cycle (propidium iodide staining ) was assessed by flow cytometry. PCR array for JAK/STAT pathway was performed in duplicates in wild type and treated cell lines and the value of the fold change (2-ΔΔCt) was calculated for all genes. Proteins Beclin-1 (autophagy) and XBP-1s (UPR) were chosen for Western Blotting analysis. Results: RPMI-8226, presented lower expression of JAK1 when compared to U266, without statistically significant difference for JAK2 expression. Of the 30 patients recent diagnosed with MM, 57% presented overexpression of JAK2 and 27%, of JAK1. However, JAK1 and JAK2 expression did not correlate with survival and clinical features of MM patients. The concentrations for the drugs combination were: ruxolitinib (30 μM for RPMI-8226; 40 μM for U266) and bortezomib (10 nM). After 72 hours of treatment with and ruxolitinib and borezomib combination (R+B), RPMI-8226 and U266 presented 50% of cells in late apoptosis. Cell death in both cell lines was accompanied by reduction of anti-apoptotic genes after R+B treatment. RPMI-8226 showed higher number of cells in SubG0 phase (p<0.001) after R+B treatment with reduction of cells in S (p<0.01) and G2/M (p<0.001) phases. There were no alterations in cell cycle for U266 cell line, except for a slight increase in SubG0 phase cells (p<0.05). RPMI-8226 presented 50% of cells in late apoptosis after R+B treatment, but co-culture protected these cells from apoptosis (32%) (p<0.001). The addition of immunomodulatory drug lenalidomide reversed the protective effect of stromal cells and combination of three drugs (ruxolitinib, bortezomib and lenalidomide) induced 62% of cell death in tumor cells (p<0.05). The treatment, in co-culture, with ruxolitinib, bortezomib and lenalidomide was equivalent to the treatment with bortezomib, lenalidomide and dexamethasone, drug combination used in clinical practice. The expression profile of the JAK/STAT pathway in the cell lines treated with R+B, when compared with respective RPMI-8226 or U266 wild type, showed that many JAK/STAT, Ras/Raf/MAPK and PI3K/Akt/mTOR pathways genes had their expression reduced, mainly in RPMI-8226, with insignificant changes in U266 expression pattern. After R+B treatment, there was an increase in XBP-1s expression. Conclusion: This study demonstrated the overexpression of JAK2 in almost 60% of patients with MM, besides the effects of JAK1/2 inhibitor, ruxolitinib, on late apoptosis, cell cycle and JAK/STAT pathway gene and protein expression. In this scenario, the JAK/STAT pathway could pose as a new therapeutic target to be exploited, since it is constitutively active and contributes to survival of MM tumor cells.

Introdução: A ativação constitutiva das proteínas JAK em mieloma múltiplo (MM) promove a sobrevivência e proliferação de células tumorais. O bloqueio das proteínas JAK pode contribuir para reduzir os efeitos auxiliares da sinalização aberrante nas células de mieloma e a inibição farmacológica das JAKs pode, portanto, ser uma estratégia terapêutica para o tratamento do mieloma. Objetivos: 1) Identificar, em linhagens celulares de MM, a existência de expressão relevante dos genes da via JAK/STAT JAK1 e JAK2 e validar os achados em amostras de pacientes recém-diagnosticados com MM; 2) Realizar estudos funcionais in vitro com as linhagens celulares de MM previamente selecionadas, em monocultura e co-cultura com células estromais normais, tratadas com um inibidor da via JAK/STAT (ruxolitinibe), associado a outras drogas utilizadas atualmente no tratamento de primeira linha do MM; 3) Avaliar a expressão global dos genes da via JAK/STAT e de proteínas de interesse em linhagens celulares de MM previamente selecionadas, selvagens e tratadas in vitro com o inibidor da via JAK/STAT. Métodos: A expressão dos genes JAK1 e JAK2 foi analisada por PCR em tempo real (qPCR). Para os experimentos in vitro, com ruxolitinibe, bortezomibe, e a combinação das duas drogas, as concentrações foram determinadas após verificação de qual dose é capaz de induzir pelo menos 50% de morte celular. A apoptose (marcação com anexina V e iodeto de propídeo) e o ciclo celular (marcação com iodeto de propídeo) foram analisados por citometria de fluxo. O PCR array para a via JAK/STAT foi avaliado em duplicatas com células tratadas com a combinação de ruxolitinibe e bortezomibe e não tratadas e o valor do fold change (2-ΔΔCt) foi calculado para todos os genes. As proteínas Beclina-1 (autofagia) e XBP-1s (UPR) foram escolhidas para avaliação por Western Blot. Resultados: A linhagem RPMI-8226 apresentou menor expressão do gene JAK1, quando comparada à linhagem U266, e não houve diferença estatisticamente significante para a expressão do gene JAK2. Dos 30 pacientes recém-diagnosticados com MM, 57% apresentaram hiperexpressão de JAK2 e 21%, de JAK1. Porém, a expressão de JAK1 e JAK2 não apresentou correlação com a sobrevida ou com as características clínico-laboratoriais dos pacientes. As concentrações utilizadas para a combinação das drogas foram: ruxolitinibe (30 μM para RPMI-8226 e 40 μM para U266) e bortezomibe (10 nM). Após 72 horas de tratamento com a combinação de ruxolitinibe e bortezomibe (R+B), as linhagens RPMI-8226 e U266 apresentaram 50% de células em apoptose tardia. A morte celular nas duas linhagens foi acompanhada por diminuição de expressão dos genes anti-apoptóticos após tratamento com R+B. A linhagem RPMI-8226 apresentou maior número de células na fase SubG0 (p<0,001) após tratamento com R+B e redução de células nas fases S (p<0,01) e G2/M (p<0,001). A linhagem U266 não apresentou alterações no ciclo celular, exceto por um pequeno aumento de células na fase SubG0 (p<0,05). A co-cultura com células estromais protegeu as células RPMI-8226 tratadas com combinação de R+B da apoptose, já que a porcentagem de células em apoptose caiu para 32% (p<0,001), em relação à monocultura. A adição da droga imunomoduladora lenalidomida reverteu o efeito protetor conferido pelas células estromais, já que a combinação de ruxolitinibe, bortezomibe e lenalidomida causou 62% de morte celular nas células tumorais (p<0,05). O tratamento em co-cultura com ruxolitinibe, bortezomibe e lenalidomida foi equivalente ao tratamento com bortezomibe, lenalidomida e dexametasona, combinação utilizada na prática clínica. O perfil de expressão dos genes da via JAK/STAT nas células tratadas com R+B, quando comparado ao perfil das respectivas linhagens selvagens, mostrou diminuição de expressão de genes das vias JAK/STAT, Ras/Raf/MAPK e PI3K/Akt/mTOR, principalmente na linhagem RPMI-8226, com mudanças insignificantes no padrão de expressão da linhagem U266. Após tratamento com R+B, houve aumento na expressão proteica de XBP-1s. Conclusão: Neste trabalho, demonstramos que existe aumento de expressão do gene JAK2 em quase 60% dos pacientes com MM, além dos efeitos do inibidor de JAK1/2, ruxolitinibe, na apoptose tardia, ciclo celular e expressão de genes da via JAK/STAT, em pelo menos uma das linhagens celulares de MM. Nesse cenário, a via JAK/STAT pode configurar como um alvo terapêutico a ser explorado, já que se encontra constitutivamente ativa em uma porcentagem relevante de pacientes e contribui para a sobrevivência de células tumorais do MM.
Keywords Multiple Myeloma
Jak
Stat
Ruxolitinib
Mieloma Múltiplo
Jak
Stat
Ruxolitinibe
Language Portuguese
Date 2017-04-11
Research area Doenças Linfoproliferativas Crônicas
Knowledge area Onco Hematologia
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 75p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5380444
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50387

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