Estudo da modulação de fatores epigenéticos em células tcd4+ ativadas após curtos períodos de exposição ao vírus da imunodeficiência humana tipo 1(HIV-1)

Estudo da modulação de fatores epigenéticos em células tcd4+ ativadas após curtos períodos de exposição ao vírus da imunodeficiência humana tipo 1(HIV-1)

Author Furtado, Maria Nadiege Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Janini, Luiz Mario Ramos Janini Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Infectologia
Abstract Introduction: In Brazil, data released by the United Nations (UN) recently, highlight an increase of 11% in the index of new AIDS cases among parents in 2005 until 2013, the report says there are 730 000 people infected with HIV in the country which represents a rate of 2% of the world population and yet 16 000 people died of AIDS last year alone. One of the factors that prevent the elimination of HIV-1 in infected patients and viral latency. Many factors are involved in the establishment and maintenance of HIV latency, including the organization of chromatin in regions of viral integration by epigenetic modifications. Preliminary results from our laboratory, obtained from microarray expression of genes related to epigenetic modifications and chromatin remodeling, revealed in HIV -1 up regulation in the expression of RSK2 and SETDB2 cells, genes involved in silencing and increase of gene transcription respectively. Denoting thus the need for a more detailed study of these genes during the process of viral infection. Objectives: The aim of the present work was to study epigenetic factors related to RSK2 and SETDB2 proteins modulated in activated CD4 T cells over 36 hours of exposure to HIV -1. Materials and methods: From a packed red blood cells and leukocytes , peripheral blood mononuclear cells were separated by density gradient using the reagent Ficcoll Paque , the CD4 T lymphocytes were purified from PBMCs and activated for subsequent infection with HIV -1 T - tropic . Infections were halted in 6hrs, 12hrs, 24hrs and 36hrs for obtaining samples of DNA, RNA and protein. The DNA samples were used for analysis of proviral and control of infections by quantitative PCR methodology, the extracted RNAs were used for gene expression analysis of RSK2 and SETDB2 by quantitative PCR methodology and the proteins obtained and used to analyze the expression protein by Western blot. Results: In times of 24 and 36 hours a decrease in the level of phosphorylation of the substrates RSK2 and also related to this protein in the up-downstream events, such as the level of phosphorylation of Erk, serine 10 histone was observed H3, CREB, and the nuclear transcription factor NF-kB, which interacts RSK2 degrading proteins inhibit the translocation of this factor to the nucleus. Simultaneously, in the same time there was an increase of SETDB2 and brand exerted by this protein that is the tri - methylation of lysine 9 of histone H3 is a mark of gene silencing. Conclusion: It´s changes in the proteins analyzed and the events they run evidenced by the times of 24 and 36 hours seem to be crucial during the first replication cycle of HIV occurred after these times , but from what it was possible to realize a modulation of these factors for routing a state of gene silencing . We cannot determine whether such modifications are carried by the virus in an attempt to manipulate the cell environment or carried by cellular defense mechanisms more detailed studies are needed to elucidate this issue. We can understand that times 24 and 36 hours after viral infection are important and that epigenetic modifications that target one gene silencing longer happen. Manipulate this environment and to study other factors that may act in these initial steps may be the way to understanding the mechanism of latency and the key to its reversal.

Introdução: No Brasil, em dados divulgados pela ONU (Organização das Nações Unidas) recentemente, destacam um aumento de 11% no índice dos novos casos de aids nos país dentre 2005 até 2013, segundo o relatório existem 730 mil pessoas infectadas com HIV no país o que representa uma taxa de 2% da população mundial alem disso, 16 mil pessoas morreram de aids somente no ano passado. Um dos fatores que impede a erradicação do HIV-1 nos pacientes infectados é a latência viral. Muitos fatores estão envolvidos no estabelecimento e manutenção da latência do HIV, incluindo a organização da cromatina nas regiões de integração viral por modificações epigenéticas. Resultados preliminares obtidos em nosso laboratório, a partir de micro-arranjo de expressão de genes relacionados às modificações epigenéticas e remodelamento da cromatina, revelaram em células infectadas pelo HIV-1uma maior regulação na expressão de RSK2 e SETDB2, genes envolvidos com aumento e silenciamento da transcrição gênica respectivamente. Denotando assim, a necessidade de um estudo mais detalhado destes genes durante o processo de infecção viral. Objetivo: O objetivo geral do presente trabalho foi estudar fatores epigenéticos relacionados às proteínas RSK2 e SETDB2 moduladas em células TCD4 ativadas ao longo de 36 horas de exposição ao HIV-1. Materiais e métodos: A partir de um concentrado de hemácias e leucócitos, foram separadas células mononucleares do sangue periférico por gradiente de densidade utilizando o reagente Ficoll Paque, os linfócitos TCD4 foram purificados a partir de PBMCs e ativados para posterior infecção com HIV-1 T-trópico. As infecções foram interrompidas nos tempos de 6h, 12h, 24h e 36h para obtenção de amostras de DNA, RNA e proteína. As amostras de DNA foram utilizadas para análise de DNA proviral e como controle das infecções pela metodologia de PCR quantitativa, os RNAs extraídos foram utilizados para análise de expressão gênica de RSK2 e SETDB2 pela metodologia de PCR quantitativa e as proteínas obtidas, utilizadas para a análise de expressão e modificação proteica por Western Blot. Resultados: Nos tempos de 24 e 36 horas foi observada uma diminuição no nível de fosforilação de RSK2 e também dos substratos relacionados á esta proteína e em pontos desta via de sinalização, como por exemplo, o nível de fosforilação de Erk, da serina 10 da histona H3, de CREB e do fator de transcrição nuclear NF-kB, a qual RSK2 interage degradando as proteínas que inibem a translocação de tal fator para o núcleo. Simultaneamente, nos mesmos tempos foi verificado um aumento de SETDB2 e da modificação exercida por esta proteína que é a tri-metilação da lisina 9 da histona H3, que é uma alteração relacionada ao silenciamento gênico. Conclusão: Evidenciamos que principalmente nos tempos de 24 e 36 horas do ciclo replicativo do HIV ocorreram modificações nas proteínas analisadas por este estudo e nos seus efeitos modificando outros substratos. Além disto, foi possível perceber a modulação destes fatores para um encaminhamento de um estado de silenciamento gênico. Não podemos definir se tais modificações são exercidas pelo vírus na tentativa de manipular o ambiente celular ou por mecanismos de defesa da célula, estudos mais detalhados são necessários para elucidar esta questão. Conseguimos perceber que os tempos de 24 e 36 horas após a infecção viral são importantes e que modificações epigenéticas que direcionam para um silenciamento gênico já acontecem. Manipular este ambiente e estudar outros fatores que podem agir nestas etapas iniciais pode ser o caminho para a compreensão do mecanismo de latência e a chave para sua reversão.
Keywords hiv-1
latência viral
repressão epigenética
transcrição genética inativação gênica
Language Portuguese
Date 2014-08-29
Published in FURTADO, Maria Nadiege. Estudo da modulação de fatores epigenéticos em células tcd4+ ativadas após curtos períodos de exposição ao vírus da imunodeficiência humana tipo 1(HIV-1). 2014. 90 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.
Research area Medicina
Knowledge area Ciências da saúde
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 90 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=1093438
Access rights Closed access
Type Dissertation
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/48583

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