Glicogênio sintase quinase 3 e autofagia como alvos moleculares do carbonato de lítio e ácido ursólico em leucemias: possível aumento da atividade da ara-c

Glicogênio sintase quinase 3 e autofagia como alvos moleculares do carbonato de lítio e ácido ursólico em leucemias: possível aumento da atividade da ara-c

Author Santos, Caroline Palmeira dos Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Trindade, Claudia Bincoletto Trindade Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Farmacologia
Abstract Objectives: To evaluate the molecular mechanisms involved in the increased cytotoxic effects of Ara-C for lithium carbonate (LIT) in leukemic cells HL-60, and examine possible antileukemic properties of ursolic acid (URS), firstly alone, aiming studies in combination therapy with Ara-C. Methods: The leukemic lines HL-60 and NB4 were used as study models in the following tests: MTT reduction; incorporation of trypan blue dye; evaluation of cell death by labeling fragmented DNA; analysis of the cell cycle phases with propidium iodide; evaluation of modalities of cell death by simultaneous labeling with propidium iodide (PI) and annexin-V-FITC; semi- quantitation of the p62, LC3-II PRAM-1, RAR? and GSK3-? proteins by Western Blotting; assessing the activation of caspase-3 protein; clonal culture assay; immunophenotyping to CD11b and CD15; production and infections of lentivirus and assessment of morphological changes by Leishman stain. Results: Initially, referring to the possible increase of the cytotoxic effects of Ara-C by LIT in NB4 cells, it was found that LIT was not cytotoxic when used alone and did not increase the cytotoxic effects of Ara-C in this lineage. In relation to the increase of Ara-C activity in HL-60 cells, verified in previous studies, using the LIT as inhibitor of glycogen synthase kinase 3 (GSK3), it was verified na partial involvement of caspase-3 protein in AC+LIT association. Although the cells treated with Ara-C have shown significant decrease in protein expression levels of RAR?, increase in CD11b marker and decrease in CD15, these parameters were not altered when these associated LIT. It was also observed that silencing GSK3-? inhibited the increase of the cytotoxic effects of Ara-C by LIT, denoting the importance of this signaling pathway in the increase of the cytotoxic activity of Ara-C by LIT. The studies using the URS demonstrated significant cytotoxic effects in a concentration and time dependent manner, triggering many different cell death types, such as necrosis, apoptosis and late apoptosis after 4 hours of exposure. The URS also decreased the number of colonies, modulates autophagy and led the formation of vacuoles. The URS did not affect the cell differentiation markers CD11b and CD15, nor levels of PRAM-1 protein in NB4 cell line. The effects of URS for both cell lines were not cycle-dependent, once changes in cell cycle phases were not observed. URS did not alter the levels of GSK3-? protein, and did not increase the cytotoxic effects caused by Ara-C. Conclusions: It is suggested that the increase in cytotoxic effects of Ara-C depend on LIT inhibiting GSK3-?, thus stimulating further studies aimed at elucidating this action for future therapeutic targets in leucemias.Regarding the antileukemic effects of URS, this was significantly cytotoxic to the cell lines, possibly due to its modulation of the autophagic process and formation of vacuoles, effects that occurred independently of actions on the cell cycle and in GSK3-?, suggesting thus lower cytotoxic activity for normal tissues, that stimulates preclinical studies for possible application in antileukemic therapy.

Objetivos: Avaliar os mecanismos moleculares envolvidos no aumento dos efeitos citotóxicos da Ara-C pelo carbonato de lítio (LIT) em células leucêmicas HL-60, e analisar as possíveis propriedades antileucêmicas do ácido ursólico (URS), a princípio sozinho, objetivando estudos em terapias combinadas com a Ara-C. Métodos: As linhagens leucêmicas HL-60 e NB4 foram utilizadas como modelo de estudos nos seguinte ensaios: Redução de MTT; incorporação do corante vital azul de tripano; avaliação de morte celular pela marcação de DNA fragmentado; análise das fases do ciclo celular com iodeto de propídeo; avaliação das modalidades de morte celular pelo marcação simultânea com iodeto de propídeo (PI) e anexina-V-FITC; semi- quantificação das proteínas p62, LC3-II, PRAM-1, RAR? e GSK3-? por Western Blotting; avaliação da ativação da proteína caspase-3; ensaio de cultura clonal; imunofenotipagem para CD11b e CD15; produções e infecções lentivirais e a avaliação de alterações morfológicas pela técnica de coloração de Leishman. Resultados: Inicialmente, referente ao possível aumento dos efeitos citotóxicos da Ara-C pelo LIT em células NB4, foi verificado que este último não foi citotóxico quando utilizado de forma isolada, e não aumentou os efeitos citotóxicos da Ara-C nesta linhagem. Em relação ao aumento da atividade da Ara-C em células HL-60, verificado em estudos anteriores, utilizando o LIT, inibidor da via glicogênio sintase quinase 3 (GSK3), foi verificado o envolvimento parcial da proteína caspase-3 na associação AC+LIT. Embora as células tratadas com Ara-C tenham apresentado diminuição significativa nos níveis de expressão proteica de RAR?, aumento do marcador CD11b e diminuição de CD15, estas não tiveram estes parâmetros alterados quando associadas ao LIT. Foi observado ainda que o silenciamento de GSK3-? inibiu o aumento dos efeitos citotóxicos de Ara-C pelo LIT, denotando assim a importância desta via de sinalização do aumento da atividade citotóxica da Ara-C pelo LIT. Já os estudos utilizando o URS demonstraram que este possui efeitos citotóxicos significativos de maneira concentração e tempo dependentes, desencadeando morte celular dos tipos necrose, apoptose secundária e apoptose a partir de 4 horas de exposição. O URS também diminuiu a formação de colônias, modulou a autofagia e levou a formação de vacúolos. O URS não alterou os marcadores de diferenciação celular CD11b e CD15 e nem os níveis da proteína PRAM-1 na linhagem NB4. Os efeitos do URS em ambas as linhagens não foram ciclo-dependentes, pois não foram verificadas alterações das fases do ciclo celular. O URS também não alterou os níveis da proteína GSK3-?, assim como não aumentou os efeitos citotóxicos causados pela Ara-C. Conclusões: Sugere-se que o aumento dos efeitos citotóxicos de Ara-C pelo LIT depende da inibição de GSK3-?, estimulando estudos adicionais visando a elucidação desta ação para futuros alvos terapêuticos nas leucemias. Quanto aos efeitos antileucêmicos do URS, este foi significativamente citotóxico para as linhagens, possivelmente devido a sua modulação sobre o processo autofágico e formação de vacúolos, efeitos estes que ocorreram de forma independente de ações sobre o ciclo celular e da via GSK3-?, sugerindo assim menor ação citotóxica para tecidos normais, o que estimula estudos pré-clínicos para possível aplicação na terapia antileucêmica.
Keywords leukemia
cell death
ara-c
gsk3-beta
ursolic acid
lithiun
leucemia
morte celular
ara-c
gsk3-beta
acido ursólico
litio
Language Portuguese
Date 2016-08-31
Published in SANTOS, Caroline Palmeira dos. Glicogênio sintase quinase 3 e autofagia como alvos moleculares do carbonato de lítio e ácido ursólico em leucemias: possível aumento da atividade da ara-c. 2016. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.
Research area Farmacologia
Knowledge area Ciências biológicas
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=3773648
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/47180

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