Estudo da fibrose no músculo esquelético mediada por receptores de angiotensina e tratamento do músculo lesionado por prp e terapia gênica

Estudo da fibrose no músculo esquelético mediada por receptores de angiotensina e tratamento do músculo lesionado por prp e terapia gênica

Author Stilhano, Roberta Sessa Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Han, Sang Won Han Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Ciências Biológicas (Biologia Molecular)
Abstract process, which frequently occurs in cases of deeper muscle injury, leads to imperfect tissue regeneration. The current therapies have a low efficacy for prevention or treatment of the complications caused by fibrosis, such as atrophy, contraction and pain followed by functional loss and post-traumatic fibrosis. Hypertension is a contributing factor in fibrosis, and angiotensin II (Ang II), which is the main responsible for vasoconstriction, seems to trigger signaling fibrosis. There is communication between TGFB1 and Ang II signaling pathway in cardiac muscle. In parallel, there is a discordant discussion of GM-CSF role in skeletal muscle fibrosis. To better understand the fibrotic process occurring after injury in skeletal muscle, first of all, we established a muscle injury model followed by suture, which produces a deep lesion developing fibrosis largely muscle. To evaluate the possible role of the AT1 and GM-CSF in promoting fibrosis, multiple vectors were constructed, including, Lv-mirAT1a expressing a microRNA to silence the expression of AT1a protein and Lv-GM-CSF expressing GM-CSF. Considering that the injection of lentiviral solution in skeletal muscle may not be efficient for transduction of these vectors and cause leakage to other tissues, an alginate hydrogel was formulated for carrying lentivetores. The animals treated with alginate hydrogel loaded with Lv-GM-CSF and Lv-mirAT1a drastically reduced muscle fibrosis. Thus, it was inferred that the AT1a should participate in the fibrotic process of skeletal muscle and its inhibition is a good strategy for reducing post-injury fibrosis. On the other hand, the effect of the expression of GM-CSF in the control of fibrosis varied depending on the inflammatory progression, or its expression and the onset of inflammation-accentuated fibrosis, but expression in late stage drastically reduced fibrosis, confirming the results of our previous work. The mediators of fibrosis, such as angiotensin and growth factors are present in plasma and in sports medicine, the platelet rich plasma (PRP) is widely used to treat various types of lesions, including muscle injury. In an attempt to correlate the above studies with these factors in PRP, the molecular and cellular content of that preparation was evaluated. Two methods for preparation of PRP were established in the literature database and were named LPRP and PPRP. The main difference between the two preparations is the presence of leukocytes (LPRP) or not (PPRP), but the molecular and cellular contents thereof vary markedly PRPs. NIH3T3 cell lines (fibroblasts) and C2C12 (myoblast) grown with 1% PRP, and 10% FBS promoted cell proliferation in different patterns. The expression gene expression profile of 6 growth factors were analyzed and showed that each PRP for each cell type expression level of these genes is significantly variable. In conclusion, it was demonstrated that AT1 participates in skeletal muscle fibrosis and the inhibition of AT1 via microRNA is a good alternative to reduce fibrosis. Forced expression of GM-CSF early in the muscle injury promotes the formation of fibrosis, but their expression days later drastically reduces fibrosis. For late expression of GM-CSF via lentivetor contained in loco, the alginate hydrogel formulation with lentivetor developed here was ideal. As for PRPs, leukocytes contained in LPRP takes the PRP formation with different quality and amount of cells and molecules, hence its effect on the target cells were different.

A fibrose é um processo que faz parte da recuperação tecidual, mas quando este processo é exacerbado, que frequentemente ocorre nos casos de lesões musculares mais profundas, leva a regeneração imperfeita do tecido. Os tratamentos atuais têm uma baixa eficácia para prevenção ou tratamento das complicações causadas pela fibrose tais como atrofia, contratura e dor seguida de perda funcional e fibrose pós-traumática. A hipertensão é um fator que contribui na fibrose, e a angiotensina II (Ang II), que é a principal responsável pela vasoconstrição, parece desencadear a sinalização de fibrose. Há uma comunicação entre as vias de sinalização de TGFB1 e Ang II no músculo cardíaco. Em paralelo há uma discussão discordante do papel do GM-CSF na fibrose do músculo esquelético. Para melhor compreender o processo fibrótico que ocorre no músculo esquelético pós-lesão, inicialmente foi estabelecido um modelo de lesão muscular seguido de sutura, que produz uma lesão profunda desenvolvendo fibrose em grande parte do músculo. Para avaliar a possível participação do AT1 e GM-CSF na promoção da fibrose, vários vetores foram construídos, entre eles, Lv-mirAT1a que expressa um microRNA para silenciar a expressão da proteína AT1a e Lv-GM-CSF que expressa GM-CSF. Tendo em vista que a injeção de solução lentiviral no músculo esquelético pode não ser eficiente para transdução desses vetores e provocar vazamento para outros tecidos, um hidrogel de alginato foi formulado para carrear lentivetores. Os animais tratados com o Lv-mirAT1a ou Lv-GM-CSF carreado no hidrogel de alginato reduziram drasticamente a fibrose muscular. Assim, inferiu-se que o AT1a deverá participar do processo fibrótico do músculo esquelético e sua inibição é uma boa estratégia para redução de fibrose pós-lesao. Por outro lado, o efeito da expressão do GM-CSF no controle da fibrose variou em função da progressão inflamatória, ou seja, sua expressão bem no inicio da inflamação acentuou fibrose, mas sua expressão na fase tardia reduziu drasticamente a fibrose, confirmando os resultados nossos de trabalhos anteriores. Os mediadores de fibrose, como angiotensina e fatores de crescimento, estão presentes no plasma, e na medicina do esporte o plasma rico em plaquetas (PRP) é muito utilizado para tratar vários tipos de lesões, inclusive a lesão muscular. Na tentativa de correlacionar os estudos acima com os fatores presentes nos PRP, o conteúdo molecular e celular desse preparo foi investigado. Dois métodos para preparação de PRP foram estabelecidos na base de dados da literatura e foram denominados de LPRP e PPRP. A xx diferença principal entre as duas preparações é a presença de leucócitos (LPRP) ou não (PPRP), mas o conteúdo celular e molecular destes PRPs variou acentuadamente. As linhagens celulares NIH3T3 (fibroblasto) e C2C12 (mioblasto) cultivadas com 1 % PRPs e 10 % SFB promoveram proliferação celular em diferentes padrões. O perfil de expressão de genes de 6 fatores de crescimento analisados mostrou que cada PRP para cada tipo celular o nível de expressão destes genes é variável significativamente. Em conclusão, demonstrou-se que o AT1 participa na fibrose do músculo esquelético e sua inibição via microRNA é uma boa alternativa para redução de fibrose. A expressão forçada do GM-CSF no início da lesão muscular promove a formação de fibrose, mas sua expressão nos dias depois reduz drasticamente a fibrose. Para expressão tardia do GM-CSF através do lentivetor e de forma contida in loco, a formulação do hidrogel de alginato com lentivetor desenvolvida aqui foi ideal. Quanto aos PRPs, os leucócitos contidos no LPRP leva a formação de PRP com qualidade e quantidade diferente de células e moléculas, consequentemente, seus efeitos nas células alvo foram bem diferentes.
Keywords gene therapy
fibrosis
microrna
angiotensin
alginate
muscle
fibrose
fibras musculares esqueléticas/patologia
plasma rico em plaqueta
angiotensina
micrornas
Language Portuguese
Date 2015-12-17
Published in STILHANO, Roberta Sessa. Estudo da fibrose no músculo esquelético mediada por receptores de angiotensina e tratamento do músculo lesionado por prp e terapia gênica. 2015. 120 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.
Research area Bioquímica
Knowledge area Ciências biológicas
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 120 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=2661939
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/47124

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