Enzimas lisossomais em células renais em cultura submetidas a condições que mimetizam o estado diabético

Enzimas lisossomais em células renais em cultura submetidas a condições que mimetizam o estado diabético

Author Peres, Giovani Bravin Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Michelacci, Yara Maria Correa da Silva Michelacci Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Ciências Biológicas (Biologia Molecular)
Abstract Diabetic nephropathy affects about one third of ali diabetic patients, and is the most common cause of end-stage renal disease. By the use of intravital microscopy and fluorescent albumin, it has been shown that the renal filtration of albumin in normal rats is almost 50 times the values previously reported, obtained by micropuncture. As the albumin concentration in normal urine is very low, it seems that there is a retrieval pathway, possibly in proximal tubular cells. Internalized albumin may either be retrieved back to circulation via transcytosis or follow Iysósomal degradation, with fragments being exocytosed back into tubular lumen and excreted in urine. So, increased albuminuria in diabetic patients could be due to lower renal degradation rates of albumin. We have recently reported decreased expression and activities of Iysosomal proteases, especially cathepsins B and L, in kidney during the early stages of diabetes (10 and 30 days) in rats. Important morphological changes were observed in proximal tubules, which have lost their brush borders and presented thinner walls, in comparison to normal. Immunohistochemistry have shown that most of cathepsin B is localized in proximal tubular cells, suggesting that these cells are implicated in the early stages of the disease. Despite ali this information concerning Iysosomal enzymes and diabetes, the mechanisms that trigger these changes are unknown. The aim of the present study was to investigate the effects of high glucose and advanced glycation end products (AGEs) upon Iysosomal enzymes in kidney cells. Immortalized cell lines derived from kidney cells were submitted to conditions that mimic the diabetic state - high glucose and/or AGE-albumin (AGE-BSA) - and their effecfs upon cell proliferation, expression and activities of Iysosomal enzymes, and expression of other mediators of inflammation and cell metabolism were studied. The results have demonstrated that high glucose increased the proliferation rates of mesangial cells only (CMHI), while epithelial tubular cells were not affected. Although control-BSA had no effect upon the proliferation rate of the cells here studied, AGE-BSA caused a marked decrease in the number of both epithelial and mesangial cells, in a dose-dependent fashion, irrespectively of glucose concentration in culture medium Concerning Iysosomal enzymes, the main cysteine-protease in ali the renal-derived cells here studied was cathepsin B, although its concentration was much lower in mesangial than in epithelial cells. Exposure to high glucose had no effect on the activity of the enzyme, but AGE-BSA caused a marked decrease in LLCPK only, while increases were observed in the other cell lines. Furthermore, the levels of nitric oxide (NO) produced and secreted to the culture media were also increased by AGE-BSA in ali cell types here studied, suggesting oxidative stress. Concerning the expression of some proteins, Western blotting has shown that, among the investigated proteins, the mammalian (mechanistic) target of rapamycin - mTOR - was the most significantly affected by exposure to AGE-BSA.

A nefropatia diabética afeta cerca de um terço de todos os pacientes diabéticos e é a principal causa de estágio final de doença renal. Com o uso de microscopia intravital e albumina fluorescente, demonstrou-se que a filtração renal de albumina em ratos normais é cerca de 50 vezes os valores previamente reportados, obtidos por micropunção. Como a concentração de albumina na urina normal é muito baixa, aparentemente há uma via de recuperação, possivelmente envolvendo células tubulares -proximais, A albumina internalizada pode tanto ser devolvida de volta para a circulação, via transcitose, ou seguir a degradação lisossomal, com fragmentos exocitados de volta para o lúmen tubular e excretados para a urina. Logo, o aumento da albuminuria em pacientes diabéticos pode ser devido às baixas taxas de degradação da albumina. Recentemente, nós reportamos uma queda na expressão e na atividade.de proteases lisossomais, especialmente catepsina B e L, no rim de ratos diabéticos durante os estágios iniciais da doença (10 e 30 dias). Alterações morfológicas importantes foram observadas nos túbulos proximais, que perderam sua borda em escova e apresentaram paredes mais delgadas, em comparação com ratos normais. Catepsina B foi localizada por imunohistoquímica principalmente nas células tubulares proximais, sugerindo que essas células estão envolvidas com o estágio inicial da doença. Apesar de toda essa informação acerca das enzimas lisossomais e diabetes, os. mecanismos que levam a essas mudanças são desconhecidos. O objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos da alta glicose e de produtos de glicação avançada (AGEs) sobre as enzimas lisossomais de células renais. Linhagens imortalizadàs derivadas de células renais foram submetidas a condições que mimetizam o estado diabético - alta glicose e/ou albuniina-AGE (BSA-AGE) - e seus efeitos sobre a proliferação celular, expressão e atividade de enzimas lisossomais, bem como a expressão de mediadores da inflamação e do metabolismo celular foram estudados. Os resultados revelaram que a alta glicose aumentou a taxa de proliferação apenas das células mesangiais (CMHI), enquanto as células epiteliais não foram afetadas. Ainda que controle-BSA não possuiu efeito sobre a velocidade de proliferação das células, BSA-AGE causou uma queda acentuada (dose dependente) no número de todas as células, independentemente da concentração de glicose no meio de cultura. Em relação às enzimas lisossomais, a principal cisteíno-protease foi catepsina B, embora a concentração tenha sido muito menor nas células mesangiais do que nas epiteliais. A exposição a alta glicose não apresentou efeito sobre a atividade da enzima, mas BSA-AGE causou uma acentuada queda apenas em LLCPK, enquanto um aumento foi observado nas outras linhagens. Além disso, os níveis de óxido nítrico (NO) produzido e secretado no meio de cultura estavam aumentados em todas as células expostas a BSA-AGE, sugerindo estresse oxidativo. Com relação a expressão de algumas proteínas, experimentos de Western blottíng revelaram que entre os alvos investigados, mTOR (mammalian target of rapamycin) foi o mais significativamnete afetado pela exposição com BSA-AGE
Keywords diabetes mellitus
lysosomal enzymes
cathepsin
nephropathy
proxirnal tubular cell
diabetes mellitus
enzimas lisossomais
catepsina
nefropatia
célula tubular proxirnal
Language Portuguese
Date 2016-08-31
Published in PERES, Giovani Bravin. Enzimas lisossomais em células renais em cultura submetidas a condições que mimetizam o estado diabético. 2016. 296 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.
Research area Bioquímica
Knowledge area Ciências biológicas
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 296 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=3686685
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/46633

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